判断PCR检测体系的灵敏度是否满足要求，关键在于通过标准品梯度稀释确定最低检测限（LOD），并验证其在实际样本中的稳定性。以下是具体方法：
一、标准品梯度稀释法
?标准品选择?：使用合成DNA片段或冻干标准菌株，确保浓度准确（如10?–101 copies/mL）。
?稀释梯度?：至少做5个数量级连续稀释（如10?、10?、10?、103、102 copies/mL），每个浓度做3次平行重复。
?qPCR检测?：记录Ct值，当Ct值<40且扩增效率E在0.9–1.1之间时，视为阳性。
?计算LOD?：通过线性方程Cq= -klgX?+b计算最低检测限，E=10?1/?–1。
二、实际样本验证
?模拟真实环境?：使用临床样本（如羊粪便、血液）进行检测，避免基质效应干扰。
?重复性测试?：同一浓度样本多次检测，标准偏差≤0.2，确保结果稳定。
三、关键参数验证
?扩增效率（E）?：E在0.9–1.1之间（90%–110%）表示扩增接近理想情况。
?相关系数（R2）?：R2>0.98时，说明标准曲线可信度高。
四、实际应用建议
?试剂盒选择?：参考阔盘吸虫通用染料法荧光定量PCR试剂盒（50次货号：zy-61300），其灵敏度可达几百拷贝/反应。
?反应体系设置?：根据仪器调整参数（如ABI7500需ROX对照）。
