西尼罗病毒PCR检测试剂盒实验操作步骤
扩增反应体系配制
在无菌PCR管中依次加入以下组分（以25μL体系为例）：
- 2× PCR Master Mix：12.5μL
- 西尼罗病毒特异性引物探针混合液：2μL
- 模板DNA/RNA：5μL
- RNase-free水：补足至25μL
轻柔混匀后瞬时离心，避免气泡产生。若检测样本为RNA，需在反应体系中加入逆转录酶（根据试剂盒说明调整比例）。
PCR扩增程序设置
将反应管置于实时荧光PCR仪中，按以下程序运行：
- 逆转录（仅RNA检测）：50℃ 15分钟
- 预变性：95℃ 3分钟
- 扩增循环（40次）：95℃ 15秒 → 60℃ 45秒（荧光信号采集）
结果分析与判读
- **阳性对照**：Ct值≤35且扩增曲线呈典型S型。
- **阴性对照**：无Ct值或Ct值≥40。
- **待测样本**：Ct值<38且曲线正常判为阳性；Ct值≥38需重复检测；无扩增曲线为阴性。
实验注意事项
- 严格分区操作：试剂配制区、样本处理区、扩增区需物理隔离，避免交叉污染。
- 防RNA降解：RNA样本需全程置于冰上，使用无RNase耗材。
- 数据记录：保存扩增曲线与Ct值，异常结果需结合电泳或测序验证。
废弃物处理
实验结束后，所有接触样本的耗材需经121℃高压灭菌30分钟，液体废弃物按生物危害等级处理。
