磷脂酶C(PLC)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

磷脂酶 C（EC3.1.4.3）是一种水解甘油磷酸酯 C3 位点甘油磷酸酯键的脂类水解酶，广泛存 在于微生物及动植物的组织和细胞中。
测定原理：

磷脂酶 C 催化水解 NPPC 产生对硝基苯酚，在 410nm 处有特征吸收峰。 自备实验用品及仪器 天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水 浴锅。
试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：液体 102mL×1 瓶，4℃保存。 试剂二：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。 试剂三：液体 8mL×1 瓶，4℃保存。
酶液提取：
1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL 提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 离心 30min，弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。 2. 细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒， 总时间 3min）；然后于 4℃，10000g 离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 离心 30min， 弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。 3. 血清：直接测定。
测定操作：
空白管 测定管 样品（μL） 20 试剂一（μL） 20 试剂二（μL） 100 100 充分混匀，37℃反应 30min 试剂三（μL） 80 80 充分混匀，于微量石英比色皿/96 孔板，蒸馏水调零，测定 410nm 处吸光值，分别记为 A 空 白管和 A 测定管，△A=A 测定管-A 空白管。
计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下 标准曲线：y = 0.0191x - 0.0103，R 2 = 0.9991 1．按照蛋白浓度计算 酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活 力单位。 PLC 活性（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T= 17.45×（△A+0.0103）÷ Cpr 2．按照样本质量计算 酶活性定义：每克组织每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力 单位。 PLC 活性（nmol/min/g 鲜重）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V 反总÷(V 样÷V 样总×W) ÷T = 17.45×（△A+0.0103）÷ W 3．按照细胞数量计算 酶活性定义：每 104个细胞每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活 力单位。 PLC 活性（nmol/min/104 cell）=（△A+0.0103）÷ 0.0191×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量) ÷T = 17.45×（△A+0.0103）÷ 细胞数量 4．按照液体体积计算 酶活性定义：每毫升血清每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活 力单位。 PLC 活性（nmol/min/mL）= （△A+0.0103）÷ 0.0191×V 反总÷V 样÷T = 17.45×（△A+0.0103） V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积， 1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min b. 用 96 孔板测定的计算公式如下 标准曲线：y = 0.0095x - 0.0103，R 2 = 0.9991 1．按照蛋白浓度计算 酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活 力单位。 PLC 活性（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T = 35.09×（△A+0.0103）÷ Cpr 2．按照样本质量计算 酶活性定义：每克组织每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活力 单位。 PLC 活性（nmol/min/g 鲜重）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V 反总÷(V 样÷V 样总×W) ÷T = 35.09×（△A+0.0103）÷ W 3．按照细胞数量计算 酶活性定义：每 104个细胞每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活 力单位。 PLC 活性（nmol/min/104 cell）=（△A+0.0103）÷ 0.0095×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量) ÷T =35.09×（△A+0.0103）÷ 细胞数量 4．按照液体体积计算 酶活性定义：每毫升血清每分钟水解 NPPC 产生 1nmol 对硝基苯酚所需的酶量为一个酶活 力单位。 PLC 活性（nmol/min/mL）= （△A+0.0103）÷ 0.0095×V 反总÷V 样÷T = 35.09×（△A+0.0103） V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积， 1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min
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