乳酸脱氢酶(LDH)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

LDH（EC 1.1.1.27）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是糖酵解途径的末端酶， 催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应，伴随着 NAD+ /NADH 之间互变。
测定原理：

LDH 催化 NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸进一步与 2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二 硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 板、研钵、冰和蒸馏水。 
试剂组成和配制：

提取液：60mL×1 瓶， 4℃保存； 试剂一：液体 5 mL×1 瓶， 4℃保存； 试剂二：粉剂×1 支，-20℃保存，用时加入 10μL 试剂五和 1.3 mL 蒸馏水充分溶解备用，用 不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融； 试剂三：液体 5 mL×1 瓶，4℃保存； 试剂四：液体 20 mL×1 瓶，4℃保存； 试剂五：液体 100μL×1 支，4℃保存；
样品测定的准备：
 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104个）：提取液体积（mL）为 1000~5000：1 的比例（建议 2000 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）样品：直接检测。
测定操作：
 1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 450nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（在 EP 管中加入下列试剂） 试剂名称(μL) 测定管 对照管 样本 10 10 试剂一 50 50 试剂二 10 蒸馏水 10 充分混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确水浴 15min 试剂三 50 50 充分混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）准确水浴 15min 试剂四 150 150充分混匀，室温静置 15min， 450 nm 下测定吸光度，计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测 定管需要设一个对照管。
计算公式：
 a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1、标准条件下测定的回归曲线， y = 0.9108x+0.0037 (x 为标准品浓度，umol/mL；y 为 ΔA)。 2、血清（浆）LDH 活力的计算 单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH（nmol/min/mL）=（ΔA-0.0037）÷0.9108÷T×103 =73.2×ΔA 3、细胞、细菌和组织中 LDH 活力的计算 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH（nmol/min/mg prot）=[（ΔA-0.0037）÷0.9108×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =73.2×ΔA÷Cpr 需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。 （2） 按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH（nmol/min/g 鲜重）=[（ΔA-0.0037）÷0.9108×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =73.2×ΔA÷W （3）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH（nmol/min/104 cell）= [（ΔA-0.0037）÷0.9108×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.037×ΔA V1：加入反应体系中样本体积，0.01mL；V2：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，15 min； Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细胞或细菌总数，2000 万；103：1umol/mL=103 nmol/mL。 b.使用 96 孔板测定的计算公式如下： 1、标准条件下测定的回归曲线， y = 0.4554x+0.0037 (x 为标准品浓度，umol/mL；y 为 ΔA)。 2、血清（浆）LDH 活力的计算 单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH（nmol/min/mL）=（ΔA-0.0037）÷0.4554÷T×103 =146.4×（ΔA-0.0037） 3、细胞、细菌和组织中 LDH 活力的计算 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH（nmol/min/mg prot）=（[ ΔA-0.0037）÷0.4554×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =146.4×（ΔA-0.0037） ÷Cpr 需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。 （2） 按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH （ nmol/min/g 鲜 重 ） =[ （ ΔA-0.0037 ） ÷0.4554×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =146.4× （ΔA-0.0037）÷W （3）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。 LDH（nmol/min/104 cell）= [（ΔA-0.0037）÷0.4554×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.073× （ΔA-0.0037）V1：加入反应体系中样本体积，0.01mL；V2：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，15 min； Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细胞或细菌总数，2000 万；103：1umol/mL=103 nmol/mL。 1、 标准曲线线性范围为：0.1 umol/mL -2 umol/mL。 2、 ΔA 线性范围为：0.01 -1。
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