顺乌头酸酶(ACO)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

顺乌头酸酶（aconitase），三羧酸循环中的酶，催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不 易氧化，在顺乌头酸酶作用下，通过脱水与加水反应，使羟基由β碳原子转移到α碳原子上， 生成易于脱氢氧化的异柠檬酸，为进一步的氧化脱羧反应作准备。
测定原理：

ACO 催化柠檬酸转化成异柠檬酸，异柠檬酸氧化脱羧将 NAD+ 还原生成 NADH，导致 340nm 处光吸收上升。需自备的仪器和用品 紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、 研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：

试剂一：100mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂二：20mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂三：1.5mL×1 支，-20℃保存； 试剂四：液体 20mL×1 瓶，4℃保存； 试剂五：液体 5mL×1 瓶，4℃保存； 试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加 1.5mL 蒸馏水充分溶解；现配现用 试剂七：粉剂×1 支，4°保存；临用前加 12mL 试剂四充分溶解； 工作液：临用前在 12mL 试剂七中加入 1mL 蒸馏水、1mL 试剂四、1mL 试剂五、1mL 试 剂六充分混匀
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： 1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器 或研钵匀浆。 2、 将匀浆转入离心管内 600g，4℃离心 5min。 3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。 4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定胞质顺乌头酸酶活性。 5、 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体顺乌头酸酶活性测定。
测定操作：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 2、 样本测定 （1）将工作液，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min；现配现用；若分 次用将工作液分装后于-20°保存，一星期内可用。 （3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 40μL 样本 160μL 工作液，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 3min20s 后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。
计算公式：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下（1） 按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。 ACO 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(Cpr×V 样) ÷T=268×ΔA÷Cpr （2） 按样本鲜重计算 单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。 ACO（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=54×ΔA÷W （3） 按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。 ACO 活性（nmol/min/10 4 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.108×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10 -4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10 3 L / mol /cm；d：比 色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.04 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T： 反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总 数，500 万。 b.用 96 孔板测定的计算公式如下 （1） 按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。 ACO 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(V 样×Cpr) ÷T=536×ΔA÷Cpr （2） 按样本鲜重计算 单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活性单位。 ACO（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=108×ΔA÷W （3） 按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶 活性单位。 ACO 活性（nmol/min/10 4 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10 9]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.216×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10 -4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10 3 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.04 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL； T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞 总数，500 万。
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