琥珀酸脱氢酶(SDH)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

SDH（EC 1.3.5.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。SDH 是线粒体的一种标 志酶，位于线粒体内膜上的一种膜结合酶，是连接呼吸电子传递和氧化磷酸化的枢纽之一。 此外，为多种原核细胞产能的呼吸链提供电子。
测定原理：

SDH 催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸（PMS）传递还原 2,6- 二氯酚靛酚（DCPIP），并且在 600nm 处具有特征吸收峰，通过 600nm 吸光度的变化，测定 2．6-DPIP 的还原速度，代表 SDH 酶活性。 需自备的仪器和用品 酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：

试剂一：100mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂二：20mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂三：1.5mL×1 支，-20℃保存； 试剂四：20mL×1 瓶，4℃保存； 试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 2mL 蒸馏水溶解待用，用不完的试剂继续 4℃保 存； 试剂六：粉剂×1 支，-20℃避光保存；临用前加入 2mL 蒸馏水溶解待用，用不完的试剂 4℃ 避光保存一周。
样本的前处理：
 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： 1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器 或研钵匀浆。 2、 将匀浆液于 600g（离心率），4℃离心 5min。 3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g（离心率），4℃离心 10min。 4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 SDH（此步可选做）。 5、 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 SDH 活性测定。
测定操作：
 1、 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 600nm。 2、 样本测定 在 96 孔板中加入 15μL 样本、15μL 试剂五和 155μL 试剂四，混匀， 加入 15μL 试剂六， 混匀，测定 600nm 处 3min 时的吸光值 A1 和反应 20 分钟后 23min 时的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。
计算公式：
 （1） 按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 SDH 活性（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T= 63.5×ΔA÷Cpr （2） 按样本鲜重计算 单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 SDH 活性（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T = 12.8×ΔA÷W （3） 按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 SDH 活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T =0.0256×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm； d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.015 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，20 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细 菌或细胞总数，500 万。
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