己糖激酶(HK)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

HK（EC 2.7.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第 一个关键酶，催化葡萄糖转化为 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交 叉点。
测定原理：

HK 催化葡萄糖合成 6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化 6-磷酸葡萄糖脱氢生成 NADPH，NADPH 在 340nm 有特征吸收峰。 需自备的仪器和用品 紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 20mL×1 瓶， 4℃保存； 试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存； 试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存；
样本的前处理 ：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提 取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 3、血清（浆）样品：直接检测。
测定操作：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 2、 样本测定 （1）在试剂二中加入 18mL 试剂一充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种） 水浴 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 （2）在试剂三中加入 1mL 试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止 反复冻融。 （3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂三和 180μL 试剂二，混 匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 5min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。 注意：不同匀浆组织中 HK 活力不一样，做正式试验之前请做 1-2 只预试，若 ΔA>0.5，则 说明组织活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍 数），或缩短反应时间至 2min,使 ΔA<0.5，以提高检测灵敏度。
计算公式：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1、血清（浆）HK 活性 单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 HK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷V 样÷T=643×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 HK 活性 （1）按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 HK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算 单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 HK（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W （3）按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 HK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.286×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总 数，500 万。 b.用 96 孔板测定的计算公式如下 1、血清（浆）HK 活性 单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 HK（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷V 样÷T=1286×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 HK 活性 （1）按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 HK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算 单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 HK（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W （3）按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 HK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.572×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总 数，500 万。
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