几丁质酶测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

几丁质主要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨)， 以及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2.1.14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的 作用，成为病害的研究热点。
测定原理：

几丁质酶水解几丁质产生 N-乙酰氨基葡萄糖，进一步与 DNS 试剂反应产生棕红色化合物， 在 540nm 处有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了几丁质酶的活性。 自备实验用品及仪器： 天平、水浴锅、离心机、酶标仪、96 孔板、蒸馏水。
试剂组成和配制：

提取液：液体 120mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：液体 6mL×1 瓶，4℃保存。 试剂二：液体 15mL×1 瓶，4℃避光保存。
酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃离心 20min，取上清，置冰上待测。 2. 真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒， 总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。 3. 培养液：直接测定。
测定操作：
对照管 测定管 粗酶液（μL） 100 100 提取液（μL） 150 50 试剂一（μL） 100 混匀，37℃水浴 1h。沸水浴 5min 终止反应，冷却后 8000rpm，4℃，离心 10min，取上清， 蒸馏水稀释 10 倍待用 上清 175 175 试剂二（μL） 125 125 混匀，95℃水浴 5min，室温冷却。吸取 200μL 至 96 孔板，测定 540nm 下吸光值 A 测定与 A 对照，ΔA=A 测定-A 对照。
计算公式：
标准条件下测定回归方程为 y = 3.2054x - 0.2753，R2 = 0.9984；x 为标准品浓度（mg/mL）， y 为吸光值。 1、 按照样本重量计算 酶活性定义：37℃条件下，每克组织每小时分解几丁质产生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量 为一个酶活性单位。 几丁质酶活性（mg/h/g 鲜重）=（ΔA+ 0.2753）÷3.2054×V 反总÷(V 样÷V 样总×W) ÷T×10 = 7.799×（ΔA+ 0.2753）÷W 2、 按照蛋白质浓度计算酶活定义：37℃条件下，每毫克蛋白每小时分解几丁质产生 1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量 为一个酶活单位。 几丁质酶活性（mg/h mg prot）=（ΔA+ 0.2753）÷3.2054×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T×10 = 7.799×（ΔA+ 0.2753）÷Cpr 3、 按细胞数量计算 酶活定义：37℃条件下，每 104个细胞每小时分解几丁质产生 1mgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量 为一个酶活单位。 几丁质酶活性（mg/h /104 cell）=（ΔA+ 0.2753）÷3.2054×V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)×10 = 7.799×（ΔA+ 0.2753）÷细胞数量 4、按液体体积计算 酶活定义：37℃条件下，每毫升培养液每小时分解几丁质产生 1mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶 量为一个酶活单位。 几丁质酶活性（mg/h /mL）=（ΔA+ 0.2753）÷3.2054×V 反总÷V 样×10 = 7.799×（ΔA+ 0.2753） V 反总：反应体系总体积，0.25mL；V 样：反应体系中样本体积，0.1mL；V 样总：加入提 取液体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；10，稀释倍数。 注意事项： 1、 如果吸光值超过 2，说明样本中还原糖含量较高，需要额外稀释，并在 结果中乘以 相应倍数。
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