天冬酰胺合成酶(AS)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

天冬酰胺合成酶是广泛存在于生物体内的一类氨基转移酶，催化谷氨酰胺的氨基向天冬氨酸 转移。当植物处于氨毒时天冬酰胺的形成是一种反应。
测定原理：

AS 催化 L-天冬酰胺水解成 L-天冬氨酸和氨，利用奈氏试剂检测氨增加的速率，即可计算其 酶活性。 需自备仪器和用品： 台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液枪、研钵、冰 和双蒸水。
试剂组成和配制：

试剂一：液体 60mL×2 瓶，4 ℃保存； 试剂二：粉剂×2 瓶，4 ℃避光保存；临用前每瓶加入 25mL 蒸馏水充分溶解待用，现配现 用； 试剂三：液体 60 mL×1 瓶，常温保存； 试剂四：液体 5 mL×1 瓶，常温保存； 试剂五：液体 3 mL×1 瓶，常温保存； 试剂六：液体3 mL×1瓶，常温避光保存。
提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试 剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）样品：直接检测。
测定操作：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 420nm，蒸馏水调零。 2、样品测定（在 EP 管中加入下列试剂）： 试剂名称（uL） 测定管 对照管 样本 25 蒸馏水 25 试剂一 100 100 试剂二 400 400 混匀，37℃水浴 1 小时 试剂三 525 525 混匀，8000 g，25℃离心 10 min；取上清液，在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂 上清液 130 130试剂四 30 30 试剂五 20 20 试剂六 20 20 混匀，室温静置 15min，420nm 处读取测定管和对照管吸光值，计算 ΔA=A 测定管-A 对照 管。对照管只要做一管。 注意： 1、试剂六如出现沉淀，静置后取上清使用。 2、ΔA（A 测定管-A 对照管）若出现负值，可能是酶活性较低，可将反应时间 1h 延长到 2h，相应的在计算公式中除以 2。
计算公式：
标准条件下测定的回归方程为 y = 1.9244x + 0.0057，R2 = 0.9983；x 为标准品浓度（μmol/mL）， y 为吸光值 A。 1、血清（浆）AS 活性 单位定义：每 mL 血清（浆）每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。 AS (nmol /min /mL)＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V 反总÷V 样÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057) 2、组织、细菌或细胞 AS 活性 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位定义：每 mg 蛋白质每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。 AS (nmol /min /mg prot)＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷Cpr。 （2）按样本鲜重计算： 单位定义：每 g 组织每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。 AS (nmol/min /g 鲜重)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷W。 （3）按细菌或细胞密度计算 单位定义：每 1 万个细菌或细胞每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。 AS (nmol/min/104 cell) ＝ (ΔA-0.0057)÷1.9244×V 反 总 ÷(500×V 样 ÷V 样 总 ) ÷T ×1000 =0.7274×(ΔA -0.0057) V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，60min；V 反总：反应体系总体积，1.05mL； V 样：加入反应体系中样本体积，0.025mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量， g；500：细菌或细胞总数，500 万; 1000，μmol 到 nmol 换算系数。
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