甲醛脱氢酶(FDH)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

甲醛是一种能与蛋白质、核酸和脂类产生非特异性反应的活泼化合物，对所有生物都具有很 高毒性。甲醛脱氢酶作为含锌中等链醇脱氢酶（ADH）的家庭成员之一，广泛存在于原核 和真核生物中，该酶能利用 NAD+作为辅酶，将有毒的甲醛氧化，是甲醛氧化途径中的关键 酶。
测定原理：

甲醛脱氢酶催化甲醛和 NAD+产生 NADH，在 340nm 处的吸光值会增加，测定 340nm 处的 吸光值变化，可计算得到甲醛脱氢酶的活性。 自备实验用品及仪器 天平、离心机、酶标仪、96 孔板、蒸馏水。
试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 6mL 水溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃ 保存，禁止反复冻融。 试剂三：粉剂×1 支，4℃保存；临用前加入 1.5mL 水溶解待用。 试剂四：液体 1.5mL×1 支，4℃避光保存。
酶液提取：
 1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 20min。 2. 细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒， 总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。 3. 液体：直接检测。
测定操作：
 1、 酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm。 2、 操作表 在 96 孔板中加入如下试剂 测定管 样本（μL） 20 试剂一（μL） 110 试剂二（μL） 50 试剂三（μL） 10 试剂四（μL） 10 混匀，于 340nm 下测定初始吸光值 A1 与 5min 后的吸光值 A2，△A=A2-A1。 若样本数量较多，可将试剂按比例配成工作液使用。
计算公式：
 （1）按蛋白浓度计算 酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化还原 1nmol NAD+的酶量为 1 个酶活单位。

FDH 酶活（nmol/min/mg prot）= ?d ? ? A ×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T = 643×△A÷Cpr （2）按样本质量计算 酶活定义：每克样品每分钟催化还原 1nmol NAD+的酶量为 1 个酶活单位。 FDH 酶活（nmol/min/g 鲜重）= ? d ? ? A ×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T =643×△A÷W （3）按照细胞数量计算 酶活定义：每 104个细胞每分钟催化还原 1nmol NAD+的酶量为 1 个酶活单位。 FDH 酶活（nmol/min/104cell）= ? d ? ? A ×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量（万个））÷T= 643×△A÷细胞数量 （4）按液体体积计算 酶活定义：每 mL 样本每分钟催化还原 1nmol NAD+的酶量为 1 个酶活单位。 FDH 酶活（nmol/min/mL）= ? d ? ? A ×V 反总÷V 样÷T=643×△A ? ：NADH 微摩尔消光系数，6.22×10-3 L/μmol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 反总：反应 体系总体积，0.2mL；V 样：反应体系中样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL； T，反应时间，5min；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g
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