线粒体呼吸链复合体Ⅳ/细胞色素C氧化酶测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素 C 氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成 分，负责催化还原型细胞色素 C 的氧化，并最终把电子传递给氧，生成水。
测定原理：

还原型细胞色素 C 在 550nm 有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素 C 生成氧 化型细胞色素 C，因此 550nm 光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、 研钵、冰和蒸馏水。 
试剂组成和配制：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体 20mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 1.5mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂四：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；

样本的前处理：
 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆
器或研钵匀浆。
2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心 10min。
4、 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选
做）。
5、 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，
功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于复合体Ⅳ酶活性测定。

测定操作：
 1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 550nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）工作液的配制：临用前将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解，置于 37℃（哺
乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
（2）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 20μL 样本和 200μL 工作液，混匀，记录 550nm
处初始吸光值 A1 和 37℃反应 30min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。
注意点：若 ΔA 大于 0.2，需将样本用试剂二稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），
使 A1-A2 小于 0.2，可提高检测灵敏度。

计算公式：
 a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化降解 1 nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力
单位。
复合体Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(V 样×Cpr) ÷T=19.20×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复 合 体 Ⅳ 活 力 (nmol/min/g 鲜 重 )=[ΔA×V 反 总 ÷ （ ε×d ） ×109
]÷(W× V 样 ÷V 样
总)÷T=3.88×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶
活力单位。
复合体Ⅳ活力(nmol/min/104
cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.008×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2.2×10-4
L；ε：细胞色素 C 摩尔消光系数，1.91×104
L / mol /cm；
d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；
T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细
菌总数，500 万。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化降解 1 nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力
单位。
复合体Ⅳ活力(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(V 样×Cpr) ÷T=38.39×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶活力单位。
复 合 体 Ⅳ 活 力 (nmol/min/g 鲜 重 )=[ΔA×V 反 总 ÷ （ ε×d ） ×109
]÷(W× V 样 ÷V 样
总)÷T=7.76×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化降解 1nmol 还原型细胞色素 C 定义为一个酶
活力单位。
复合体Ⅳ活力(nmol/min/104
cell)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109
]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.016×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2.2×10-4
L；ε：细胞色素 C 摩尔消光系数，1.91×104
L / mol /cm；
d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202
mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细
胞或细菌总数，500 万。

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