线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

ICDHm（EC 1.1.1.41）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，在三羧酸循 中催化异柠檬酸生成 α-酮戊二酸，同时将 NAD+ 还原为 NADH，是三羧酸循环的限速酶之 一，其催化的反应是细胞 NADH 主要来源之一。 
测定原理：

ICDHm 催化异柠檬酸和 NAD+生成α-酮戊二酸和 NADH，NADH 在 340nm 下有特征吸收
峰，通过检测 340nm 处光吸收上升速率来反映 ICDHm 活性的高低。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、
研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：

试剂一：100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：20mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：1.5mL×1 支，-20℃保存；
试剂四：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 支，4℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存;

样本的前处理：
 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器
或研钵匀浆。
2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 ICDHm（此步可选做）。
5、 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或
200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 ICDHm 活性测定。

测定操作：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 样本测定
（1）在试剂五中加入 18mL 试剂四充分溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）
水浴 10min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
（2）在试剂六中加入 1mL 蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止
反复冻融；
（3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂六和 180μL 试剂五，混
匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。