线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)测试盒紫外分光光度法

商品属性：

测定意义：

MDH （EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中 MDH 是 TCA 循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果 酸。草酰乙酸是重要的中间产物， 连接多条重要的代谢途径。因此，MDH 在细胞多种生 理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧 代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH 分为 NAD-依赖的 MDH 和 NADP-依赖的 MDH，细菌中通常只含有 NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH 分布于细胞质和线粒体 中。 
测定原理：

MDHm 催化 NADH 还原草酰乙酸生成苹果酸，导致 340nm 处光吸收下降。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸馏水。

试剂一：液体 50mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体 10mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 1mL×1 支，-20℃保存；
试剂四、液体 50 mL×1 瓶，在 4℃保存；
试剂五、粉剂×2 支，-20℃保存；临用前加入 300μL 蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂
分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
试剂六、粉剂×2 支，-20℃保存；临用前加入 300μL 蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂
分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

样本测定的准备：
 
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器
或研钵匀浆。
② 将匀浆液于 600g，4℃离心 5min。
③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
④ 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 MDH（此步可选做）。
⑤ 在步骤④中的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％
或 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 MDH 测定。

测定操作：
 1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。
2、 将试剂四在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上。
3、操作表：
试剂名称（μL） 测定孔
样本 20
试剂四 760
试剂五 10
试剂六 10
将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，混匀后立即在 340 nm 波长下记录初始吸光度
A1 和反应 1min 后的吸光度 A2，计算 ΔA=A1-A2。
计算公式中乘以相应稀释倍数。