氧化型/脱氢抗坏血酸(DHA)含量测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

AsA 作为植物细胞一个重要生理指标，其 AsA 的含量、氧化还原状态(AsA/DHA 比率)及其 合成与代谢相关酶类活性的变化涉及植物对一系列环境胁迫的响应。DHA 是 AsA 的可逆的 氧化型，在生物体内，与抗坏血酸共同组成氧化还原系统，具有电子受体的作用。
测定原理：

DTT 还原 DHA 生成 AsA，通过测定体系中 AsA 的生成速率，即可计算出 DHA 含量。 自备仪器和用品：
低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、可调式移液器、
研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 100 mL×1 瓶，室温保存。
试剂二：液体 16mL×1 瓶，室温保存。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5mL 蒸馏水充分溶解。
标准品：粉剂×1 瓶， 4℃保存。临用前加入 5.743 mL 蒸馏水充分溶解；吸取 0.1 mL 上述
溶液，加入 0.9 mL 蒸馏水，混匀，即为 100μmol/L DHA。

提取：
 1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，
加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10
4个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议
500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，
总时间 3min）；12000g，4℃离心 10min，取上清液置于冰上待测。
3. 血清等液体：直接测定。

测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 265 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。
3. 标准管：依次在微量石英比色皿/96 孔板加入 20μL 标准液、160μL 预热的试剂二和 20μL
试剂三，迅速混匀后于 265nm 比色，记录 10s 和 130s 的吸光值 A1 和 A2，△A 空白管=A2-A1。
4. 测定管：依次在微量石英比色皿/96 孔板加入 20μL 上清液、160μL 预热的试剂二和 20μL
试剂三，迅速混匀后于 265nm 比色，记录 10s 和 130s 的吸光值 A3 和 A4，△A 测定管=A4-A3。
注意：标准管只需测定一次。
 
计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
DHA(nmol/mg prot) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷（Cpr×V 样）
=100×△A 测定管÷△A 标准管÷Cpr
(2). 按样本质量计算
DHA(nmol/g 鲜重) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷(W×V 样÷V 样总) =100×△A 测定管÷△A 标准管÷W
(3). 按细胞数量计算
DHA(nmol/10
4 cell) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷(W×V 样÷V 样总) =100×△A 测定管÷△A 标准管÷细胞数量
（4）按液体体积计算
DHA(nmol/mL) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷V 样
=100×△A 测定管÷△A 标准管
C 标准液：100μmol/L；V 样总：上清液总体积，1.0 mL=1 ×10
-3 L；V 标准：加入标准品体
积，0.02mL；V 样：加入样本体积，0.02mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品
质量（g）。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
DHA(nmol/mg prot) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷（Cpr×V 样）
=100×△A 测定管÷△A 标准管÷Cpr
(2). 按样本质量计算
DHA(nmol/g 鲜重) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷(W×V 样÷V 样总) =100×△A 测定管÷△A 标准管÷W
(3). 按细胞数量计算
DHA(nmol/10
4 cell) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷(W×V 样÷V 样总) =100×△A 测定管÷△A 标准管÷细胞数量
（4）按液体体积计算
DHA(nmol/mL) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷V 样
=100×△A 测定管÷△A 标准管
C 标准液：100μmol/L；V 样总：上清液总体积，1.0 mL=1×10
-3 L；V 标准：加入标准品体
积，0.02mL；V 样：加入样本体积，0.02mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品
质量（g）。
注意事项：
1. 临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。
2. 检出限为 10μmol/L。
 
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