乙酰辅酶A测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

乙酰辅酶 A 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。是生物体能源物质代谢过程中 产生的一种重要的中间代谢产物。在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、 蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶 A 汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸 化，经过这条通路 氧化生成二氧化碳和水，释放能量用于 ATP 合成。此外，乙酰辅酶 A 是合成脂肪酸，酮体，胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。 
测定原理：

苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和 NAD 生成草酰乙酸和 NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶 A
和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶 A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应，乙酰辅酶 A
含量和 NADH 的生成速率成正比，340nm 下吸光值的上升速率反应了乙酰辅酶 A 含量的高
低。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、
研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 支，-20℃保存。临用前加入 250μL 试剂五充分溶解备用；用不完的试剂分
装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂三：液体 10uL×1 支，4℃保存。临用前加入 250μL 试剂五充分溶解备用；用不完的试
剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存。临用前加入 22.5mL 试剂五充分溶解备用；用不完的试剂
分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
试剂五：液体 30mL×1 瓶，4℃保存。
工作液的配制：临用前请根据拟用工作液体积（样本数×0.23 m L），将试剂二、三和四
按照 1:1:90 的比例混合，或者直接把试剂二和试剂三加入到试剂四中混匀（可以测定 96 样）；
加样前置 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴锅中预热 30 min；现配现用；

提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试
剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；
8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，
加入 1mL 试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
 
测定操作：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min，用蒸馏水于 340nm 处调零。
2、 将工作液置 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴锅中预热 10 min。
2、取 25μL 样本和 230μL 工作液至微量石英比色皿或者 96 孔板，混匀，立即记录 340nm
处 20s 的吸光值 A1 和 80s 时的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。
 
计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为 y = 1640x + 0.012；x 为吸光值，y 为标准品浓度（nmol/mL）。
注意：本试剂盒 检测限为 1.6nmol/mL。
（1）按照蛋白浓度计算
乙酰辅酶 A含量(nmol/mg prot)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)=(1640×ΔA＋0.012) ÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
（2）按照样本质量计算
乙酰辅酶 A 含量(nmol/g 鲜重)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012)
÷W
(3 ) 按照细菌或细胞密度计算：
乙酰辅酶 A 含量(nmol/104
)=[(1640×ΔA＋0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012)÷500
V1：加入反应体系中样本体积，0.025mL；V2：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质
浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：
标准条件下测定的回归方程为 y = 3280x + 0.024；x 为吸光值，y 为标准品浓度（nmol/mL）。
注意：本试剂盒 检测限为 1.6nmol/mL。
（1）按照蛋白浓度计算
乙酰辅酶 A含量(nmol/mg prot)=[(3280×ΔA＋0.024) ×V1]÷(V1×Cpr)=(3280×ΔA＋0.024) ÷Cpr
需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
（2）按照样本质量计算
乙酰辅酶 A 含量（nmol/g 鲜重）=[(3280×ΔA＋0.024) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(3280×ΔA＋0.024)
÷W
(3 ) 按照细菌或细胞密度计算：
乙酰辅酶 A 含量（nmol/104）=[(3280×ΔA＋0.024)×V1]÷(500×V1÷V2)=(3280×ΔA＋0.024)÷500
V1：加入反应体系中样本体积，0.025mL；V2：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质
浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
 
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