蛋白质羰基测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，其含量高低表明蛋白质氧

化损伤程度的大小，是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标。
测定原理：

羰基与 2,4-二硝基苯肼反应生成红色 2,4-二硝基苯腙，在 370nm 处有特征吸收峰。自备仪器和用品:天平、恒温水浴锅、低温离心机、漩涡震荡仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿

/96 孔板、蒸馏水、无水乙醇、乙酸乙酯
试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂 0.1g×6 支，4℃避光保存。（使用前根据样品数，每支加 1mL 水溶解，每支为

10 个样品用量）

试剂二：液体 8mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体 8mL×1 瓶，4℃保存。

试剂四：液体 18mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：根据测定样品量，将乙酸乙酯和无水乙醇等体积混合。

试剂六：液体 35mL×1 瓶，4℃保存。
酶液提取：
1. 组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g
组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，于 4℃，4000g 离心 10min，取上清，加入 0.1mL
试剂一，室温放置 10min，4℃，10000g 离心 10min，取上清待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建
议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7
秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体样本：直接测定。

测定操作：
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 370nm。
2、操作表
对照管 测定管
样品（μL） 60 60
试剂二（μL） 120
试剂三（μL） 120
混匀，37℃避光反应 1h
试剂四（μL） 150 150
静置 5min，4℃，12000g 离心 15min，弃上清，留沉淀
试剂五（μL） 300 300
漩涡混匀，4℃，12000g 离心 10min，弃上清，留沉淀
试剂五（μL） 300 300
漩涡混匀，4℃，12000g 离心 10min，弃上清，留沉淀
试剂五（μL） 300 300
漩涡混匀，4℃，12000g 离心 10min，弃上清，留沉淀
试剂六（μL） 300 300
漩涡混匀，37℃温育 15min，沉淀全部溶解后，4℃，12000g 离心 15min，取上清 200μL 于
微量石英比色皿/96 孔板中，测定 A370。ΔA=A 测定管-A 对照管

计算公式：
a．用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1. 按照样本蛋白浓度计算
蛋白质羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷(V 样×Cpr) =0.227×ΔA370÷Cpr
2. 按照样本重量计算
蛋白质羰基含量（μmol/g 鲜重）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷(W ×V 样÷V 样总) =0.227×ΔA370÷W
3. 按照细胞数量计算
蛋白质羰基含量（μmol/104cell）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷(细胞数量 ×V 样÷V 样总)
=0.227×ΔA370÷细胞数量
4. 按照液体体积计算
蛋白质羰基含量（μmol/mL）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷V 样=0.227×ΔA370
V 反总：反应体系总体积，0.3 mL；ε：羰基毫摩尔消光系数，22 L/mmol/cm；d：比色皿光
径，1cm；V 样：加入样本体积，0.06 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋
白质浓度，mg/mL，W：样本质量，g
b． 用 96 孔板测定的计算公式如下
1. 按照样本蛋白浓度计算
蛋白质羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷(V 样×Cpr) =0.454×ΔA370÷Cpr
2. 按照样本重量计算
蛋白质羰基含量（μmol/g 鲜重）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷(W ×V 样÷V 样总) =0.454×ΔA370÷W
3. 按照细胞数量计算
蛋白质羰基含量（μmol/104
cell）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷(细胞数量 ×V 样÷V 样总)
=0.454×ΔA370÷细胞数量
4. 按照液体体积计算
蛋白质羰基含量（μmol/mL）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷V 样=0.454×ΔA370
V 反总：反应体系总体积，0.3 mL；ε：羰基毫摩尔消光系数，22 L/mmol/cm；d：96 孔板光
径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.06 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本
蛋白质浓度，mg/mL，W：样本质量，g
注意事项：
1. 试剂一使用前根据要测定的样品数现配，配置好后 4℃保存，若变为黑色，则不能使用。
2. 试剂二见光易分解，反应需严格避光。

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