二氢黄酮醇还原酶(DFR)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

二氢黄酮醇还原酶是类黄酮合成途径中的一个关键酶，在决定植物的花色、叶色、果色和其

他经济器官的色泽及其营养品质方面起着重要作用。
测定原理：

二氢黄酮醇还原酶作用于二氢槲皮素产生儿茶素，可与香草醛缩合形成红色化合物，在

500nm 处有特征吸收峰。自备仪器和用品:研钵、低温离心机、震荡仪、氮吹仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、水浴锅、无水乙醇、乙酸乙酯、浓盐酸。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 12mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 1.5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存，临用前加 2mL 蒸馏水溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，

禁止反复冻融。

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃避光保存，临用前加入 30mL 浓盐酸溶解待用；用不完的试剂 4℃

避光保存。
酶液提取：
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加

入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 
测定操作：
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 500nm。
2、 操作表
对照管 测定管
酶液（μL） 40 40
试剂一（μL） 140 120
试剂二（μL） 20
试剂三（μL） 20 20
混匀，30℃反应 30min
乙酸乙酯（μL） 200 200
37℃震荡 10min，取上层溶液，N2 吹干
无水乙醇（μL） 100 100
充分震荡
试剂四(μL) 300 300
混匀，25℃静置 10min，于微量石英比色皿/96 孔板中测定 500nm 处吸光
值 A。分别记为 A 对照管和 A 测定管，△A=A 测定管-A 对照管

计算公式：
a． 用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线：y=0.0184x+0.0002，R2=0.999
（1）按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在 30℃，pH7.5 条件下，每毫克蛋白每分钟分解二氢槲皮素产生 1mmol 儿茶
素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR 活性（mmol/min/mg prot）=（△A-0.0002）÷0.0184×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T÷2
= 9.06×（△A-0.0002）÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活性定义：在 30℃，pH7.5 条件下，每克组织每分钟分解二氢槲皮素产生 1mmol 儿茶素
所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR 活性（mmol/min/g 鲜重）= （△A-0.0002）÷0.0184×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T÷2
= 9.06×（△A-0.0002）÷W
V 反总：反应总体积，1mL；V 样：反应体系中样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体
积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，30min
b．用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.0092x+0.0002，R2=0.999
（1）按照蛋白浓度计算
酶活性定义：在 30℃，pH7.5 条件下，每毫克蛋白每分钟分解二氢槲皮素产生 1mmol 儿茶
素所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR 活性（mmol/min/mg prot）=（△A-0.0002）÷0.0092×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T÷2
= 9.06×（△A-0.0002）÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活性定义：在 30℃，pH7.5 条件下，每克组织每分钟分解二氢槲皮素产生 1mmol 儿茶素
所需的酶量为一个酶活力单位。
DFR 活性（mmol/min/g 鲜重）= （△A-0.0002）÷0.0092×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T÷2
= 9.06×（△A-0.0002）÷W
V 反总：反应总体积，1mL；V 样：反应体系中样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体
积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，30min

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