谷氨酸脱羧酶(GAD)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

谷氨酸脱羧酶是将谷氨酸转化成抑制性神经递质γ-氨基丁酸（GABA）的限速酶，γ-氨基丁

酸是中枢中有效的抑制性神经递质，具有增进脑活力、营养神经细胞、保持神经安定等作用，目前在医药和保健食品中已有广泛的应

用。
测定原理：

GAD 催化谷氨酸产生 GABA，利用 berthelot 反应测定 GABA 含量，从而测定 GAD 活性。自备仪器和用品:酶标仪、水浴锅、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 12mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 12mL×1 瓶，4℃避光保存；

试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃保存；

试剂四：液体 6mL×1 瓶，4℃保存；

试剂五：液体 12mL×1 瓶，4℃避光保存；

试剂六：液体 12mL×1 瓶，4℃保存；

试剂七：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。
酶液提取：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量
（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提
取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；
8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，
加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
血清（浆）样品：直接检测。

测定操作：
1、在 EP 管中加入如下试剂
混匀，40℃水浴反应 1h，95℃水浴 10 分钟终止反应，冷却至室温，取反应液待用。
试剂名称（μL） 对照管 测定管
样本 100
95℃水浴灭活样本 100
试剂一 100 100
试剂二 100 100
2、在新 EP 管中加入如下试剂
反应液 40 40
试剂三 10 10
试剂四 50 50
试剂五 100 100
混匀，室温静置 5min。
试剂六 100 100
混匀，室温静置 5min。
试剂七 200 200
混匀，取 200μL 于 96 孔板，测定 640nm 下吸光值 A 测定与 A 对照，ΔA=A 测定-A 对照，
每个测定管设一个对照管。

计算公式：
GAD 活力计算：
1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.0682x - 0.0432，R2 = 0.999；x 为标准品浓度（μmol/mL），
y 为吸光值。
2、按照蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μmol GABA 定义为一个酶活力单位。
GAD 活力(μmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0432) ÷0.0682×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T
=0.733×(ΔA+0.0432) ÷Cpr
3、按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1μmol GABA 定义为一个酶活力单位。
GAD 活力(μmol/min/g 鲜重)=(ΔA+0.0432) ÷0.0682×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总)÷T
=0.733×(ΔA+0.0432) ÷W
4、按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1μmol GABA 定义为一个酶活力单位。
GAD 活力(μmol/min/104 cell)=(ΔA+0.0432) ÷0.0682×V 反总÷(500 ×V 样÷V 样总)÷T
=0.0014×(ΔA+0.0432)
V 样：加入样本体积：0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；V 反总：反应体系总体积，
0.3mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；
T：反应时间，60min。

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