α酮戊二酸脱氢酶(αKGDH)测试盒紫外分光光度法

商品属性：

测定意义：

α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循 环调控关键酶之一，催化 α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶 A。 

测定原理：

α-KGDH 催化 α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶 A 生成琥珀酰辅酶 A、二氧化碳和 NADH，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰，以 NADH 的生成速率表示 α-KGDH 活性。 需自备的仪器和用品 紫外分  

试剂组成和配制：

试剂一：50mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂二：10mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂三：1mL×1 支，-20℃保存； 试剂四：液体 55.5mL×1 瓶，4℃保存； 试剂五：粉剂×1 支，4℃保存； 试剂六：粉剂×1 支，4℃保存； 试剂七：粉剂×1 支，4℃保存; 试剂八：粉剂×1 支，4℃保存; 试剂九：粉剂×1 支，-20℃保存; 试剂十：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 2.1mL 蒸馏水充分混匀待用；用不完的试剂分 装后-20℃保存，禁止反复冻融。工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六、试剂七、试剂八和试剂九转移到试剂四中混合溶 解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 

样本的前处理： 
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： 1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴 匀浆器或研钵匀浆。 2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。 3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。 4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 α-KGDH（此步可选做）。 5、 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 α-KGDH 活性测定。 
测定操作：
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm 处，蒸馏水调零。 2、工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min。 3、在 1mL 石英比色皿中依次加入 40μL 试剂十、60μL 样本和 1.1mL 工作液，混匀，立即 记录 340nm 处 20s 的吸光值 A1 和 2min20s 时的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。
计算公式：
α-KGDH 活性计算 （1） 按样本蛋白浓度计算 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 α-KGDH 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr （2） 按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 α-KGDH（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=325×ΔA÷W （3） 按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 α-KGDH 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.65×ΔA V 反总：反应体系总体积，1.2×10-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.06 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL； T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细 胞总数，500 万。
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