果胶甲酯化程度测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

植物细胞壁中的果胶是植物初生细胞壁的主要成分，除了起结构支撑、物质运输等作用外，还具有抵抗逆 境的作用。果胶甲酯化程度影响了细胞壁的坚韧程度及其抗性。
测定原理：

果胶甲酯键经皂化处理后释放出甲醇，甲醇被醇氧化酶转化为甲醛，与 4-氨基-3-肼基-5-巯基-1,2,4-三唑反 应生成紫红色物质，在 550nm 下测定吸光值；同时半乳糖醛酸在 70℃下与浓硫酸反应生成 5-甲酰基-2-呋喃 甲酸，5-甲酰基-2-呋喃甲酸与 3,5-二甲基苯酚反应产生有色物质，在 450nm 下有 吸光值。以甲醇生成 量与半乳糖醛酸含量的比值代表果胶甲酯化程度。 自备实验用品及仪器 天平、低温离心机、酶标仪、96 孔板、恒温水浴锅、蒸馏水、95％乙醇、硫酸。
试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。 试剂二：液体 12mL×1 瓶，4℃保存。 试剂三：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。 试剂四：液体×1 瓶，-20℃保存。临用前加入 1.5mL 试剂三溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存； 试剂五：粉剂×2 瓶，4℃保存；临用前加入 3mL 试剂一充分溶解待用，现配现用。 试剂六：液体 3mL×1 瓶，4℃保存。 试剂七：液体 2.5mL×1 瓶，4℃避光保存。
样本前处理
 称取约 0.1g 组织，加入 1mL95%乙醇，进行冰浴匀浆，10000g 4℃离心 10min，弃上清，留沉淀。沉淀中加 入 1mL 蒸馏水，充分震荡混匀后，10000g 4℃离心 10min，弃上清，留沉淀。沉淀中加入 1mL 提取液，混 匀后 90℃水浴 2h，冷却至室温，10000g4℃离心 10min，取上清待测。
测定操作：
 1.甲醇生成量测定 试剂名称（μL） 空白管 测定管 样本 100 蒸馏水 100 试剂一 100 100 混匀，室温静置 60min 试剂二 100 100 充分混匀，取反应液待用 反应液 100 100 试剂三 90 90 试剂四 10 10 混匀，37℃反应 10min，取反应液待用 在 96 孔板中加入如下试剂 反应液 40 40 试剂五 40 40震荡混匀，30℃下反应 30min 蒸馏水 120 120 混匀，测定 550nm 下吸光值 A 测定与 A 空白。ΔA1=A 测定-A 空白。 2. 半乳糖醛酸含量测定 试剂名称（μL） 测定管 样本 25 试剂六 25 置于冰浴中 浓硫酸 400 70℃水浴 10min，冷却至室温 试剂七 20 充分混匀，静置 10min 后取 200μL 于 96 孔板测定 450nm 处吸光值 A1 与 400nm 吸光值 A2，△A2=A1-A2。
计算公式：
 1.甲醇生成量计算 标曲为 y = 0.3954x + 0.0011，R 2 = 0.9999；x 为标准品浓度，μmol/mL；y 为吸光值△A1。 甲醇生成量（μmol/g）=（ΔA1-0.0011） ÷0.3954÷W×V 样总 =2.53×（ΔA1-0.0011）÷W 2.半乳糖醛酸含量计算 标准曲线为 y = 0.2585x - 0.1746，R2 = 0.9986；x 为标准品浓度，μmol/mL；y 为吸光值△A2。 半乳糖醛酸（μmol/g）=(ΔA2+0.1746) ÷0.2585÷W×V 样总 =3.87×(ΔA2+0.1746)÷W 果胶甲酯化程度（%）=甲醇生成量÷半乳糖醛酸含量× V 样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g。
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