谷胱甘肽S转移酶(GST)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

GST 是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST 是体内酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与 GSH 的巯基共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此，GST 在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外，因为 GST 具有 GSH-Px 活性，亦称为 non-Se GSH-Px，具有修复氧化破坏的大分子如 DNA、蛋白质等的功能。注意，GST 催化的反应减少 GSH 含量，但是不增加GSSG 含量。
测定原理：

GST 催化 GSH 与 CDNB 结合，其结合产物的光吸收峰波长为 340nm；通过测定340nm波长处吸光度上升速率，即可计算出 GST 活性。自备仪器和用品:低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 120mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 22mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 2 mL 蒸馏水溶解。
酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声3 秒，间隔7秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。3. 血清等液体：直接测定。
测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 340 nm，用蒸馏水调零。2. 试剂三放在 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）保温。

3. 测定管：取微量石英比色皿或 96 孔板，加入 20μL 上清液，180μL 试剂二和20μL 试剂三，迅速混匀后于 340nm 测定吸光度变化，记录 10 s 和 310 s 吸光度为 A1 和A2。注意：空白管只需测定一次。
计算公式：
GST 活性计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol/L CDNB 与GSH结合为1 个酶活单位。
GST（nmol/min/mg prot）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T
=230×(A2-A1) ÷Cpr
(2). 按样本质量计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样品每分钟催化 1nmol/L CDNB 与GSH结合为1个酶活单位。
GST（nmol/min/g 鲜重）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=230×(A2-A1)÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每 104个细胞每分钟催化 1nmol/L CDNB 与GSH结合为 1 个酶活单位。
GST（nmol/min/104 cell）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T
=230×(A2-A1) ÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1nmol/L CDNB 与GSH结合为1 个酶活单位。
GST（nmol/min/mL）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷V 样÷T
= 230×(A2-A1)
ε：产物摩尔消光系数，9.6×103 L/mol /cm；d：比色皿光径，1cm；106：1mol=1×106μmol；V 反总：反应体系总体积，220μL=2.2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议选用本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间（min），5min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol/L CDNB 与GSH结合为1 个酶活单位。
GST（nmol/min/mg prot）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T
=460×(A2-A1) ÷Cpr
(2). 按样本质量计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每克样品每分钟催化 1nmol/L CDNB 与GSH结合为1个酶活单位。
GST（nmol/min/g 鲜重）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T
=460×(A2-A1)÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每 104个细胞每分钟催化 1nmol/L CDNB 与GSH结合为 1 个酶活单位。
GST（nmol/min/104 cell）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T
=460×(A2-A1)÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：在 25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1nmol/L CDNB 与GSH结合为1 个酶活单位。
GST（nmol/min/mL）=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷V 样÷T
=460×(A2-A1)
ε：产物摩尔消光系数，9.6×103 L/mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；106：1mol=1×106μmol；V 反总：反应体系总体积，220μL=2.2×10-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议选用本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒；W ：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间（min），5min。 注意事项：
1. 样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力；
2. 细胞中 GST 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中GST 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞；
3. 本法测定 GST 活性的线性范围可达 76 μmol/min /L，测定前先用 1～2 个样做预实验，如5min 内反应不成线性，须对样品用蒸馏水稀释，计算结果乘以稀释倍数；4. 测定反映的温度对测定结果有影响，请控制在 25℃或者 37℃（哺乳动物）。

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