1、先尽量吸干净T25瓶原培养基，再加3-4ml 常温PBS轻轻润洗细胞10-20s，吸走润洗的PBS；
2、T25瓶加1ml左右胰酶，轻轻晃动培养瓶以使胰酶铺匀瓶底细胞层，将培养瓶放入37度培养箱消化；
3、消化到细胞间隙变大，但未完全脱落时加2-3ml完全培养基终止胰酶消；
4、混匀细胞，900rpm离心3-5min，弃上清；
5、加新的完全培养基轻轻重悬细胞，均匀分到新的培养瓶里，补足完全培养基，将培养瓶放回培养箱静置培养；

背景描述 A9细胞是从野生型细胞株L中分离得到的。A9细胞对HAT选择培养基敏感，并缺失了腺苷转磷酸核糖基酶与次黄嘌呤转磷酸核糖基酶；A9细胞对8-氮鸟嘌呤(0.003mg/ml)和6-硫代鸟嘌呤(0.1mM)有抗性。

别称 A9; A9 (Hamprecht); A9(Hamprecht); AG 9; GM00346; GM-346; GM346

种属 小鼠

年龄（性别） 雄性，100天

组织来源 皮下结缔组织；疏松结缔组织和脂肪；正常

生长特性 贴壁细胞

细胞形态 成纤维细胞样

生物安全等级 1

生长培养基 DMEM＋10% FBS＋1% P/S

推荐传代比例 1:3-1:4

推荐换液频率 2~3次/周

冻存条件

冻存液：55% 基础培养基+40%FBS+5%DMSO

温度：液氮

培养条件

气相：空气，95%；CO2，5%

温度：37℃

致瘤性 Yes, in nude mice.

保藏机构 ATCC; CCL-1.4 ATCC; CRL-6319 BCRC; 60138

一、细胞密度怎么计算的？
严格意义上，细胞密度需要收集细胞悬液计数细胞数量，但在实际培养过程中，并不需要为了控制细胞数量而消化细胞计数。因此，常用的细胞密度指细胞相对于生长密度的比值，贴壁细胞可以粗略的用细胞所占培养容器底面积百分比表示，即显微镜下观察培养容器底部，有细胞的区域占总区域的百分比值，当然这种表达方式受限于单个细胞生长不同密度时所占面积不同导致并不严谨，但也是相当直观、简便的表现细胞状态的一种方式；
二、培养过程中细胞碎片较多怎么处理？
1. 细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡及细胞器折光，这个属于细胞自身特性，无法清除也无法改变，大部分细胞都会有这种现象，只是不同细胞颗粒多少有区别，细胞培养体系不适应、营养缺乏、渗透压异常等均可能导致细胞内颗粒增加，建议使用合适的培养条件。
2. 细胞外的黑色颗粒大部分是细胞碎片和产物，可以先吸走培养基后用PBS润洗清除，再加新的培养基继续培养。润洗不能清除的可以换液清洗后等细胞密度70-80%左右消化处理细胞，消化完成后加完全培养基终止消化，混匀细胞，收集细胞悬液900-1000rpm(约150g)离心3min，弃上清。再加5ml PBS重悬细胞，再离心后，用完全培养基重悬接种到新的培养皿。次PBS重悬是为了去除碎片，如果平时碎片比较少，传代时可以省略PBS重悬的步骤；如果碎片很多，建议PBS多洗几次。
三、细胞具体消化时间是多久？
每个客户用的胰酶活力及消化步骤、试剂都是不一样的，不能完全规定消化时间，以实际消化效果和客户经验为准。 
四、细胞培养瓶是怎么包被的？
细胞培养瓶包被方法有很多，例如多聚赖氨酸、明胶、鼠尾胶原等，不同的包被原理和效果都不太一样，具体可以根据实际实验室条件选择合适的包被材料。注意包被后应及时使用，包被后放的时间越长效果越来越差的。
五、细胞培养过程中出现聚团现象怎么处理？
细胞传代过程中建议尽可能吹散细胞，并在显微镜下确认细胞基本分散后再接种细胞；
细胞培养建议使用培养体系并保证温度、湿度、二氧化碳浓度适宜，能有效避免细胞吹散后在贴壁时再聚团的现象， 也可以减轻细胞聚团后无法重新摊开生长的；
培养过程中轻微聚团可以稍微延长消化时间并在消化终止后将细胞悬液静置1-2min，让大团细胞下沉后尽量吸取上层的分散细胞传代，聚团过于严重的建议重新培养或者更换培养体系；