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从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白的步骤

从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白的步骤

发布时间:2019-10-23

从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白

1、配制疏水性蛋白提取液(非裂解液):1% Triton X-114,150mM NaCl, 10mM Tris-HCl,1mM EDTA,调pH值至8.0备用。


2、菌液于4℃条件下15000g离心15min收集菌体;用1ml 含有5mM MgCl2 的PBS洗涤3次,zui后于4℃条件下15000g离心15min收集菌体。


3、菌体沉淀加入1ml冷提取液,于4℃条件下放置2h,17000g离心10min,去除沉淀取上清。


4、将上述上清中的Triton X-114含量增加到2%,再加入20mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性,37℃条件下放置10min使其分层。室温下1000g离心10min使液相和去污相充分分层。


5、将液相和去污相分开,分别用10倍体积的冷bing酮在冰上沉淀45min。


6、于4℃条件下17000g离心30min,用去离子水洗涤沉淀3次。


7、将沉淀溶解在1% SDS溶液中,测定蛋白浓度,比较液相和去污相中蛋白提取效率,一般是去污相中疏水性膜蛋白较多,适于进一步蛋白实验。


8、SDS-PAGE进一步分析液相和去污相的蛋白图谱。