从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白的步骤

从新鲜样品中提取疏水性膜蛋白

1、配制疏水性蛋白提取液（非裂解液）：1% Triton X-114，150mM NaCl, 10mM Tris-HCl，1mM EDTA，调pH值至8.0备用。

2、菌液于4℃条件下15000g离心15min收集菌体；用1ml 含有5mM MgCl2 的PBS洗涤3次，zui后于4℃条件下15000g离心15min收集菌体。

3、菌体沉淀加入1ml冷提取液，于4℃条件下放置2h，17000g离心10min，去除沉淀取上清。

4、将上述上清中的Triton X-114含量增加到2%，再加入20mM的CaCl2抑制部分蛋白酶活性，37℃条件下放置10min使其分层。室温下1000g离心10min使液相和去污相充分分层。

5、将液相和去污相分开，分别用10倍体积的冷bing酮在冰上沉淀45min。

6、于4℃条件下17000g离心30min，用去离子水洗涤沉淀3次。

7、将沉淀溶解在1% SDS溶液中，测定蛋白浓度，比较液相和去污相中蛋白提取效率，一般是去污相中疏水性膜蛋白较多，适于进一步蛋白实验。

8、SDS-PAGE进一步分析液相和去污相的蛋白图谱。